SamファイルのCIGAR string, MD tagから変異(mismatch&indels)を取得する

32	99	chrA	1758	60	100M	=	1995	337	CGACCTATTACCCAGCCATAAGTTGACAACCAAATCCCTTAAACGCACTGTCTATAAGCGCATATAGTAGACGGACCGTTATCCTCATTAAGGACCATTA	5555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555	NM:i:2	MD:Z:67A21C10
18	147	chrA	1762	60	65M3D35M	=	1519	-343	CTATTACCCAGCCATAAGTTGACAACCAAATCCCTTAAACGCACTGTCTATAAGCGCATATAGAAGGACCGTTATCCTCATTCAGGACCATTAATACTGC	5555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555	NM:i:3	MD:Z:65^GAC35

samファイルにはmapping後のreadが保持されている spec
参考1

一行に1つのリードが書いてある。
それぞれのリードがリファレンスと比べて、どんな差を持っているか知りたい。
例えば、1番上のリードは2つ変異がある。
1824-1825, A=>T
1846-1847, C=>A

各列は、順に、seq name,flag(2 bitで表現されている),chr,pos,map quality,CIGAR,seq name of mate read,pos of mate read, insert size, sequence, basequality, tags... となっているspec参照。

CIGAR

CIGARはinsertion, deletion, softclipなどの位置を表す。
例えば、indelがない場合100M (リード長=100bpの場合),途中にdelがある場合30M3D70M、insの場合25M5I70Mのよう。
更に、
N : skipped bases on reference
S : soft clipping
H : hard clipping
P : padding
も使われる。Soft clipはsequenceの項に含まれているがalignしなかったもの、hard clipはalignせずsequenceの項にも含まれていない部分を指す。soft clipped readsはIGVで見るとミスマッチが連なって見える。(img)[https://www.google.co.jp/search?q=soft+clipping+reads&client=safari&rls=en&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=ml_0UqKrCofYkAWL9oGoDg&ved=0CAkQ_AUoAQ&biw=1367&bih=803#q=soft+clipped+reads&rls=en&tbm=isch] (初期設定では非表示かも)

注意点は、posはposition of left-most aligned baseなので、soft clipされた部分は含まない。(もちろんhard clipも含まない)
なので、

TCGATCGA
1  2

9Mの場合はposは上の1を指す、3S6Mの場合は2の部分を指す。

MD tag

MD tag は 61G22C15や65^GAC35のようなタグで、リファレンス配列を見ずに、ミスマッチやDeletionの配列を確認できる。(参考)[http://onetipperday.blogspot.jp/2012/07/deeply-understanding-sam-tags.html]

61G22C15であれば、61ベースリファレンスと一致(もしくはInsertion)の後、リファレンスではGだがreadでは"何か"に変わっている。その後、22ベース一致(もしくはInsertion)し、リファレンスがCのミスマッチがあり、その後15ベース一致(もしくはInsertion)している。

65^GAC35の^GACはリファレンス配列のGACの部分がdeletionになっている事を示す。

Insertionの情報はMD tagには含まれない (抜かれている)。なので、リードの各ベースのリファレンス配列における位置を確認する場合は、CIGARと組み合わせる必要がある。

ちなみに、もしMD tagが抜けている場合は、samtools calmdで補完してくれる。

1-basedと0-based

リファレンス配列に対する、ゲノム上の位置を示す場合に、1-basedと0-based positionがある。

引用:

大変わかり易い資料

sam fileは1-based positionを使っている。

今回は変異を表すのに、0-based positionを使う。

MDとCIGARを組み合わせて変異を抽出

少しややこしくて、こんな感じのコードになった。
https://github.com/usuyama/variant_parser/blob/master/sam_parser.rb

あんまり自信ない。

メインの部分は下のような感じ。

    @variants = []
    while cigar_idx < cigar.length and md_idx < md.length
      match([current_cigar.type, current_md.type]) do
        with _[:soft, _] {
          @variants << current_cigar.clone
          get_next_cigar.call
        }
        with _[_, :del] {
          current_cigar.ref = current_md.ref
          @variants << current_cigar.clone
          get_next_cigar.call
          get_next_md.call
        }
        with _[_, :mismatch] {
          @variants << Variant.new({:type => :mismatch,
                                    :ref => current_md.ref,
                                    :len => 1})
          current_cigar.len -= 1
          get_next_md.call
        }
        with _[:ins, :match] {
          @variants << current_cigar.clone
          get_next_cigar.call
        }
        with _[:match, :match] {
          if current_cigar.len > current_md.len
            @variants << Variant.new({:type => :match, :len => current_md.len })
            current_cigar.len -= current_md.len
            get_next_md.call
            get_next_cigar.call if current_cigar.len == 0
          else
            @variants << current_cigar.clone
            current_md.len -= current_cigar.len
            get_next_cigar.call
            get_next_md.call if current_md.len == 0
          end
        }
      end
    end

C++ でも実装しました。 こちら