目的

siRNAやmiRNAがseed matchするような転写産物を検索したい。
- seed配列に依存的なオフターゲット作用 の評価に。
mRNAの全長ではなく 3′UTR の配列だけを検索したい。

※ seedとは、siRNAのガイド鎖（アンチセンス鎖）またはmatureなmiRNAの、5′末端から数えて2〜8番目の7merを中心とする配列。文献により2〜7番目の6mer、2〜9番目の8merなどとされる場合もある。seedと相補的な配列がmRNAの3′UTRに存在すると、そのmRNAの分解や翻訳抑制が起こる場合がある。

方針を検討

GGGenome では、RefSeqに収録された全生物種の転写産物 NM_, NR_, XM_, XR_ を検索することができる。ただし最新のRefSeqリリースのみ。
- https://gggenome.dbcls.jp/refseq/
RefSeqリリースのキリ番（200, 205, 210, 215, ...）については、ヒトの NM_, NR_ に限定して検索することができる。さらに、RefSeqが更新されてもキリ番リリースは削除されずに残されている。
- 例： https://gggenome.dbcls.jp/hsnm_refseq215/
今回は、ヒトの NM_, NR_ をGGGenomeで検索し、検索結果のなかから3′UTRにヒットしたものを抽出することにする。
- GGGenomeは検索結果をBED形式で取得できる。3′UTRの範囲を記載したBEDファイルを用意しておき bedtools intersect すればよい。

3′UTRの範囲を記載したBEDファイルを準備

RefSeq転写産物の3′UTRの範囲をBEDに書き出すを参照
- 完成版： hs_refseq215_3utr.bed （66,326行）

GGGenomeによる検索例

たとえば、下記のようなsiRNAのseed UGAACUC と相補的な GAGUUCA という配列を3′UTRにもつ（seedマッチする）mRNAを検索する。

curl -s https://gggenome.dbcls.jp/hsnm_refseq215/-/UGAACUC.bed \
  | sed 1d \
  | awk -F "\t" '{ OFS="\t" ; gsub(/ .*/, "", $1) ; print $1,$2,$3 }' \
> GGGenome.bed

（結果 = 28,288行）

NR_028389.1	1998	2005
NR_003928.2	2210	2217
NR_028028.2	3776	3783
NR_110015.1	846	853
NR_110014.1	914	921
NR_002714.1	533	540
NM_001256867.1	1344	1351
NM_001242328.1	1344	1351
NM_001256873.1	1344	1351
NM_001242326.1	1344	1351
[...]

このファイルから3′UTRにヒットしたものを抽出する。

bedtools intersect -wa -f 1 -a GGGenome.bed -b hs_refseq215_3utr.bed \
> GGGenome.UTR3.bed

（メモ）

-f 1 なし：1塩基でも重なれば出力する。
-f 1 あり：全長が3′UTRに含まれる場合のみ出力する。
- 今回はこちらを採用。3′UTRの配列DBを作成して検索した場合と同じ結果が得られるようにする。

（結果 = 11,059行）

NM_032333.5	3691	3698
NM_014506.3	1682	1689
NM_173555.4	3111	3118
NM_019596.6	1496	1503
NM_001040273.3	2794	2801
NM_001162496.3	1415	1422
NM_020398.4	863	870
NM_001305225.4	7177	7184
NM_015090.4	9372	9379
NM_001160332.2	9387	9394
[...]

同じ転写産物に対するヒット数

同じ転写産物の3′UTRに複数のseedマッチがある場合は強く抑制される傾向があるので、転写産物ごとのヒット数を調べられるようにしておく。

awk でカウントしてみる。

cat GGGenome.UTR3.bed \
  | cut -f 1 \
  | awk -v 'OFS=\t' 'a[$0]++ {} END {
      for( key in a ){ print key, a[key] }
    }'

（結果 = 9,039行）

NM_001375706.1	1
NM_001010989.3	1
NM_001350659.2	3
NM_016089.3	1
NM_006386.5	1
NM_017970.4	2
NM_198395.2	1
NM_003012.5	1
NM_000643.2	1
NM_001348186.2	5
[...]

（確認）NM_001348186.2 の 3′UTR にはseedマッチが5箇所あるか？

オレンジ部分がCDS
緑色のハイライトがseedマッチ → OK

参考