目的
- siRNAやmiRNAがseed matchするような転写産物を検索したい。
- seed配列に依存的なオフターゲット作用 の評価に。
- mRNAの全長ではなく 3′UTR の配列だけを検索したい。
※ seedとは、siRNAのガイド鎖（アンチセンス鎖）またはmatureなmiRNAの、5′末端から数えて2〜8番目の7merを中心とする配列。文献により2〜7番目の6mer、2〜9番目の8merなどとされる場合もある。seedと相補的な配列がmRNAの3′UTRに存在すると、そのmRNAの分解や翻訳抑制が起こる場合がある。
方針を検討
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GGGenome では、RefSeqに収録された全生物種の転写産物
NM_,NR_,XM_,XR_を検索することができる。ただし最新のRefSeqリリースのみ。 - RefSeqリリースのキリ番（200, 205, 210, 215, ...）については、ヒトの
NM_,NR_に限定して検索することができる。さらに、RefSeqが更新されてもキリ番リリースは削除されずに残されている。 - 今回は、ヒトの
NM_,NR_をGGGenomeで検索し、検索結果のなかから3′UTRにヒットしたものを抽出することにする。- GGGenomeは検索結果をBED形式で取得できる。3′UTRの範囲を記載したBEDファイルを用意しておき
bedtools intersectすればよい。
- GGGenomeは検索結果をBED形式で取得できる。3′UTRの範囲を記載したBEDファイルを用意しておき
3′UTRの範囲を記載したBEDファイルを準備
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RefSeq転写産物の3′UTRの範囲をBEDに書き出す を参照
- 完成版： hs_refseq215_3utr.bed （66,326行）
GGGenomeによる検索例
たとえば、下記のようなsiRNAのseed UGAACUC と相補的な GAGUUCA という配列を3′UTRにもつ（seedマッチする）mRNAを検索する。
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UをTに置き換え、GAGTTCAをGGGenomeで検索する。 - 下記のように検索してもまったく同じ結果が得られる。
-
https://gggenome.dbcls.jp/hsnm_refseq215/-/UGAACUC
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UはTに自動で変換される。/-/で相補的な配列を検索。
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-
https://gggenome.dbcls.jp/hsnm_refseq215/-/UGAACUC
- URLの最後に
.bedをつければ検索結果をBED形式で取得できる。 - 不要な部分を削除して使いやすくしておく。
-
sed 1dで1行目（ヘッダ）を削除 -
awkで RefSeq ID, start, end のみ抜き出して出力
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curl -s https://gggenome.dbcls.jp/hsnm_refseq215/-/UGAACUC.bed \
| sed 1d \
| awk -F "\t" '{ OFS="\t" ; gsub(/ .*/, "", $1) ; print $1,$2,$3 }' \
> GGGenome.bed
（結果 = 28,288行）
NR_028389.1 1998 2005
NR_003928.2 2210 2217
NR_028028.2 3776 3783
NR_110015.1 846 853
NR_110014.1 914 921
NR_002714.1 533 540
NM_001256867.1 1344 1351
NM_001242328.1 1344 1351
NM_001256873.1 1344 1351
NM_001242326.1 1344 1351
[...]
このファイルから3′UTRにヒットしたものを抽出する。
bedtools intersect -wa -f 1 -a GGGenome.bed -b hs_refseq215_3utr.bed \
> GGGenome.UTR3.bed
（メモ）
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-f 1なし：1塩基でも重なれば出力する。 -
-f 1あり：全長が3′UTRに含まれる場合のみ出力する。- 今回はこちらを採用。3′UTRの配列DBを作成して検索した場合と同じ結果が得られるようにする。
（結果 = 11,059行）
NM_032333.5 3691 3698
NM_014506.3 1682 1689
NM_173555.4 3111 3118
NM_019596.6 1496 1503
NM_001040273.3 2794 2801
NM_001162496.3 1415 1422
NM_020398.4 863 870
NM_001305225.4 7177 7184
NM_015090.4 9372 9379
NM_001160332.2 9387 9394
[...]
同じ転写産物に対するヒット数
同じ転写産物の3′UTRに複数のseedマッチがある場合は強く抑制される傾向があるので、転写産物ごとのヒット数を調べられるようにしておく。
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awkでカウントしてみる。
cat GGGenome.UTR3.bed \
| cut -f 1 \
| awk -v 'OFS=\t' 'a[$0]++ {} END {
for( key in a ){ print key, a[key] }
}'
（結果 = 9,039行）
NM_001375706.1 1
NM_001010989.3 1
NM_001350659.2 3
NM_016089.3 1
NM_006386.5 1
NM_017970.4 2
NM_198395.2 1
NM_003012.5 1
NM_000643.2 1
NM_001348186.2 5
[...]
（確認）NM_001348186.2 の 3′UTR にはseedマッチが5箇所あるか？
- オレンジ部分がCDS
- 緑色のハイライトがseedマッチ → OK
