答え

YES

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実験（変更前）

・下記のディレクトリ構造でファイルを作成

ffmpeg.zip/
　└ bin/
　　└ ffmpeg

・該当のZIPアーカイブをS3に格納し、Lambdaレイヤーを作成。

・Lambda関数のコードを記述
・printでディレクトリを表示するだけの関数

lambda_function.py

import json
import os

print("Contents of /opt/bin directory:")
print(os.listdir('/opt/bin'))

def lambda_handler(event, context):
    # TODO implement
    return {
        'statusCode': 200,
        'body': json.dumps('Hello from Lambda!')
    }

・Lambda関数にLambdaレイヤーを設定

テスト！

CloudWatchLogsの結果、想定通りffmpegが表示されました。

実験（変更後）

・下記のディレクトリ構造に変更。binディレクトリを消しただけ。

ffmpeg.zip/
　 └ ffmpeg

・既存のffmpeg.zipを削除し変更後の同名のZIPアーカイブをS3に格納。

・この後にLambda関数をテストしてもCloudWatchLogsに何も表示されない。

・Lambdaレイヤーを更新S3のURLなど全て以前と同様。バージョン2であることを確認

・Lambda関数のLambdaレイヤーを更新。バージョン2を設定。

・テスト！
・binディレクトリは消えているので想定通りのエラー

結論

S3のオブジェクトを更新したらLambdaレイヤーの更新もしよう！（大事なことなので2回言いました。）