OrthoFinderを用いたOrthologous解析

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(2017/2/22, CentOS x86_64)

はじめに

複数種のゲノム情報を元にして、Orthologous解析を行うために OrthoFinder を用いました。
OrthoFinderでは、MCL (markov cluster algorithm)を用いてオーソログを推定します。
論文によると、OrthoFinderは、OrthoBenchを用いたベンチマーク試験では別の手法(OrthoMCLなど)よりも高速で、オーソログの分類に関しても独自の標準化で精密さを高めた優れた手法である、と記載されています。

参考

http://www.stevekellylab.com/software/orthofinder
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4531804/

OrthoFinderの考え方

オーソログは現代では人によって様々な定義で捉えられていますが、OrthoFinderでは、
"共通祖先 (Last Common Ancestor, LCA) に由来する、遺伝子重複が起こったものも含んだ、多数対多数の遺伝子"
というように定義しており、
更にそれを 複数種に拡張した"OrthoGroup" という独自の考え方のOrthologousなグループを定義しています。
筆者らは、このOrthoGroupにはオーソログだけでなく、パラログも含まれてしまうため、不完全な定義ではあると言及しつつも、一般的なOrthologous解析の用途では、大きな支障はないだろうと結論づけています。なんにせよ、パラログを区別して解析したい場合には注意が必要です。

OrthoFinderでできること

  1. OrthoGroup (OG) の推定
  2. 1生物種×1生物種のオーソロガスな遺伝子の組の推定
  3. 系統樹の作成
  4. シングルコピー遺伝子の選出

以上の4つを自動で行ってくれます。3に関しては、生物種の系統樹と、各OGに対しての系統樹をそれぞれ作成してくれます。シングルコピー遺伝子のみを用いて生物種の系統樹を作成したい場合は、自分で別の方法で行う必要があります。

インストール

OrthoFinderは、Python2.7に依存しているため、Python3.xを使っている方は、pyenvやanacondaなどで仮想環境を構築してください (参考) 。インストールには、OrthoFinder本体に加えて、BLAST+MCLFastMeDLCparをインストールする必要があります。

1. OrthoFinder

1) git cloneしてパッケージをダウンロードし、解凍します。

$git clone https://github.com/davidemms/OrthoFinder.git
$tar xzj OrthoFinder-1.1.2.tar.gz

2) orthofinderディレクトリにPATHを通します。

2. MCL, FastMe

特に注意する点はありません。Root権限がある人はsudoなどで、Root権限がない人はそれぞれのWebサイトにいってダウンロードすれば簡単にビルドできます。OrthoFinderマニュアルを参考にインストールしてください。

3. DLCper

すこし注意が必要です。
2.と同じようにインストールできるのですが、setup.pyでビルドする際にはpythonが入っているbinがあるディレクトリで行う必要があります(which pythonで確認できます)。素直に該当のディレクトリにcpしてsetup.pyを走らせるか、 --prefixオプションを使ってビルドするディレクトを指定してください。
こうしないと、PythonのmoduleであるdlcparがPythonにはいらず、OrthoFinderが動きません。

使い方

準備

  1. 解析したい複数のFastaファイル (.fa, .faa)を準備する
  2. すべてのFastaファイルを1つのディレクトリにまとめる

解析したいFastaファイルのはいったディレクトリを指定します。
なお、OrthoFinderパッケージを解凍すると、直下にFastaファイルが入ったExampleDataディレクトリが入っているのでそれでテストランをしてみるとベターです。

$python orthofinder.py -f your_fasta_dir -t 5 # -f オプションでファイルの指定, -t オプションで使用可能なスレッド数の指定。

このとき、-aオプションで OrthoFinderアルゴリズムでの並列ジョブも指定できます。以下のようにメモリを考えてクラッシュしないように設定する必要があります。

  • 0.02 GB per species for small genomes (e.g. bacteria)
  • 0.04 GB per species for larger genomes (e.g. vertebrates)
  • 0.2 GB per species for even larger genomes (e.g. plants)

解析が終わるとyour_fasta_dir直下にResults_Dateディレクトリが作られます。

結果の確認

このディレクトリ内には、以下のファイルが生成されます。

  1. Orthogroups.csv
  2. Orthogroups.txt
  3. Orthogroups_SpeciesOverlaps.csv
  4. Orthogroups_UnassignedGenes.csv
  5. Orthologues_Date (ディレクトリ) → 直下にはTreeディレクトリOrthologueディレクトリ
  6. Statistics_Overall.csv
  7. Statistics_PerSpecies.csv

Orthogroups.csvファイル

1.には推定されたOrthogroupが以下のように入っています。SpecieはTabで区切られており、遺伝子はカンマ区切りです。2.はOrthoMCLのフォーマットのバージョンです。

OG Specie1 Specie2 Specie3
OG000001 gene_s1_1, gene_s1_3 gene_s2_1, gene_s2_2 gene_s3_2
OG000002 gene_s1_2, gene_s1_4 gene_s2_3 gene_s3_1, gene_s3_3

Statisticsファイル

6.Statistics_Overall.csvには、1) 使った合計遺伝子数 2) 推定されたOGでの合計数 3) OGに分類された遺伝子の割合
などの情報が含まれています。
7.Statistics_PerSpecies.csvにはそれぞれの生物種ごとに、上のようなデータが振られています。

Treeディレクトリ、Orthologueディレクトリ

Treeディレクトリには各OGごとの系統樹のツリーファイルが作られており、直上のディレクトリには生物種の系統樹が入っています。
Orthologueディレクトリには、使用したすべての生物種に対して、それぞれ1生物種×1生物種のオーソログ遺伝子の表が作られています。

便利な機能

1. 分析終了後に新たに生物種を追加して再解析する

OrthoFinderではありがたいことに、追加機能が備わっています。
使い方としては、
1) 新しいディレクトリを作成し、追加したいFastaファイルを入れる
2) 追加したい元データのResult_Dateディレクトリ直下にあるWorkingDirectoryを以下のように指定して解析。なお、このWorkingDirectorySpecieID.txtが入っているものを指定する。

$python orthofinder -b previous_working_dir -f new_fasta_dir

2. 分析終了後に生物種を除外して再解析する

親切なことに除外もできます。
1) 元データのResult直下にあるWorkingDirectoryに入っているSpecieID.txtをエディタで開く
2) 除外したい種に#を付加してコメントアウトする
3) 以下のように解析

$python orthofinder -b previous_working_dir

3. 追加、除外を同時に行う

当然ながら追加と除外を同時にも行うことができます。追加したいFastaを準備し、SpecieID.txtを編集して、前述のFastaを新たに追加するときと同じコマンドで動かしてください。

4. その他

BLASTなどのステップのみを単独に動かすこともできます。また、MAFFTFastTreeを使った系統樹の作成も可能です。詳しくはOrthoFinderマニュアルを参照ください。