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微生物群集解析ツール QIIME 2 を使う.Part2.(QC,FeatureTable生成編)

QIIME 2 を使う.

QIIME2 はDNAのシーケンスデータから微生物解析を行うためのオープンソースのパイプラインである.クオリティの高いグラフや統計の処理を行うことが可能である.

今回は,前回の微生物群集解析ツール QIIME 2 を使う.Part1.(インストール,ファイルインポート編)の続きで,fastq ファイルのクオリティコントロール(QC)とFeature Table の作成を行う.

Fastq ファイルのクオリティコントロール(QC)を行う.

cutadapt にて、アダプター配列の除去。
341f (--p-front-f CCTAYGGGRBGCASCAG)と806r (--p-front-r GGACTACNNGGGTATCTAAT)を想定。

# cutadapt による341f (--p-front-f CCTAYGGGRBGCASCAG)と806r (--p-front-r GGACTACNNGGGTATCTAAT)のプライマー配列除去    
qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences demux-paired-end.qza --p-cores 4 --p-front-f CCTAYGGGRBGCASCAG --p-front-r GGACTACNNGGGTATCTAAT --o-trimmed-sequences primer-trimmed-demux-paired-end.qza --verbose

# Summarise the reads
qiime demux summarize --i-data primer-trimmed-demux-paired-end.qza --o-visualization primer-trimmed-demux-paired-end.qzv

DADA2はIllumina のアンプリコン配列を検出し修正するパイプラインである.Phix配列やキメラ配列をフィルタリングしてくれる.

公式チュートリアルでは,dada2 denoise-singleになっているが,今回のデータはpaired-end のデータなのでdada2 denoise-pairedで実行する.
deblur error "Argument to parameter 'demux' is not a subtype of SampleData[SequencesWithQuality]."

dada2 denoise-paired メソッドでは,4つのパラメータを与える.

--p-trim-left-f x:各シーケンスのforward 配列の初めからx個目までを削除する.
--p-trim-left-r y:各シーケンスのReverse 配列の初めからy個目までを削除する.


--p-trunc-len-f m:各シーケンスのforward 配列のm個の塩基を採用する最大配列長を決定する. m個以降の塩基は除去する.
--p-trunc-len-r n:各シーケンスのreverse 配列のn個の塩基を採用する最大配列長を決定する. n個以降の配列は除去する.

v3-v4 の場合,460bp が重なるようにするので300,270とか460を超える長さで実行する.

--p-n-threads k:解析に使用するスレッド数を指定する.


qiime dada2 denoise-paired \
  --i-demultiplexed-seqs primer-trimmed-demux-paired-end.qza \
  --p-trim-left-f 0 \
  --p-trim-left-r 0 \
  --p-trunc-len-f 280 \
  --p-trunc-len-r 200 \
  --o-representative-sequences rep-seqs-dada2.qza \
  --o-table table-dada2.qza \
  --o-denoising-stats stats-dada2.qza \
  --p-n-threads 30
# 名前を変更する(別にしなくても良いがqiime2のチュートリアルでの汎用性を考えてここでは変更しておく)
mv rep-seqs-dada2.qza rep-seqs.qza
mv table-dada2.qza table.qza

Feature Table の生成とサマライズを行う.

クオリティのフィルタリングが完了したら,結果を調べるためにFeature Table を生成する.

feature-table summarize:各サンプルに関連付けられているシーケンスの数、各特徴、それらの分布のヒストグラムを出力する.
feature-table tabulate-seqs:Feature ID のシーケンスへのマッピングとNCBI database に対するBLAST検索のリンクを提供する.

# metadata ファイルをダウンロードする
wget -O "sample-metadata.tsv" ""
curl -sL "" > "sample-metadata.tsv"

# サマライズの実行
qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv \
  --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv

qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs.qza \
  --o-visualization rep-seqs.qzv


DAD2の公式ドキュメントにおいて、「How can I remove primers/adapters/etc from my amplicon reads?」という項目にて、重要なことが書かれている。


If primers are at the start of your reads and are a constant length (a common scenario) you can use the trimLeft = c(FWD_PRIMER_LEN, REV_PRIMER_LEN) argument of dada2’s filtering functions to remove the primers.

For more complex situations (e.g. heterogenity spacers, variable length amplicons such as the ITS region) we recommend the cutadapt tool or the trimmomatic tool. You can see a worked example, including verification of primer removal, in the ITS-specific version of the DADA2 workflow.

Please double-check that your primers have been removed! The ambiguous nucleotides in unremoved primers will interfere with the dada2 pipeline.

微生物研究をしています。微生物多様性を高めて、健康な都市を創ります!慶應SFCで微生物のゲノム解析論文を複数投稿、国内外の学会で複数発表。世界を変える30人 Forbes 30UNDER30 Japan 受賞、Tokyo Startup Gateway 2020 最優秀賞、SONY U24 CO-CHALLENGE 2020 準グランプリなど。UVERworldを心から愛しています!
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