CellRangerでカスタムリファレンスを使う。

CellRangerでカスタムreferenceを使ったときのメモ。
公式サイトに説明がある。
https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr

既存のマウスリファレンス(refdata-gex-mm10-2020-A)にGFPを足す。
10XのCustom Panel Designer （https://cloud.10xgenomics.com/custom-panel-designer) を使うと楽。
まずは、Custom Panel DesignerのCreate New Panelを選択。
Panel nameはテキトー、ReferenceはMouse、Productsはsingle cell gene expressionを選択し、Continueをクリック。

次のページでCustom Panelが選ばれている状態でContinueをクリック。
Custom Panel Designerはendoとexo合わせて１０個の遺伝子をリストにしないといけない仕様なので、exogenousにGFPだけを追加したいときには、9個の遺伝子をCustom geneとして選択する必要がある(謎仕様)。

ここではSox遺伝子の詰め合わせを作ってContinue。
(Sox1,Sox2,Sox3,Sox4,Sox5,Sox6,Sox7,Sox8,Sox9)

そうすると次のページで "9 unique genes successfully identified~"と出てくるので、確認して、Add 9 genes to Designを選択。
最後にGFPをfasta形式でコピペ

GFP_fasta

>EGFP
ATGGTGAGCAAG...

その後Continueをおして、次ページでAdd 1 sequence to Designをおして、次ページでFinish and Generate Design Filesをクリック。

あとは、３After sequencing, use the files below to analyze your data.から、Custom Sequences GTF fileとCustom Sequences FASTA fileをダウンロード。

あとはterminalで

make_custom_reference

cp refdata-gex-mm10-2020-A/genes/genes.gtf mm10_custom.gtf
cp refdata-gex-mm10-2020-A/fasta/genome.fa mm10-custom.fa
cat GFP.custom_sequences.gtf >> mm10_custom.gtf
cat GFP.custom_sequences.fa >> mm10_custom.fa

cellranger mkref --genome=customref-mm10-2020-A \
--fasta=mm10-custom.fa \
--genes=mm10-custom.gtf 

使うときは、--transcriptome=customref-mm10-2020-Aとすれば問題なく使えるはず。